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投稿者: ゲスト 投稿日時: 2014-10-30 15:05:42
Mesure de l'activité de TGF. l'activité du TGF a été mesurée en utilisant le dosage de PAI une activité de la luciférase dans des cellules epitheliales pulmonaires de vison transfectée de manière stable avec un contruct d'expression contenant un promoteur tronqué PAI 1 fusionné à un gène rapporteur de luciférase de luciole (26). L'addition de TGF actif de ces cellules entraîne une expression de la luciférase dépendante de la dose. Cellules épithéliales pulmonaires de vison transfectées ont été étalées dans des plaques à 96 puits à raison de 1,6 104 cellules par puits dans du DMEM avec 10% de FCS et on les laisse s'attacher pendant 4 h. Le milieu contenant du sérum a ensuite été retiré et remplacé par du milieu conditionné de fibroblastes, les contrôles ou les normes TGF dilué dans le milieu approprié. Les contrôles pour chaque groupe étaient composés de 1) DMEM, 2) du DMEM + 10% de FCS, ou 3) du DMEM + 10% de milieu Ultroser G seul placé sur plastique, une couche de collagène, ou d'un gel de collagène traité de la même manière que le dispositif expérimental groupes de fibroblastes. Les surnageants et les contrôles de culture de fibroblastes ont été dilués avec du DMEM + 0,1% BSA selon les besoins pour le dosage. Après 18 h d'incubation avec le milieu conditionné, les cellules ont été lavées avec du PBS et lysées à 4 avec un tampon de lyse fourni dans le kit de dosage de la luciférase accrue de Analytical Luminescence Laboratories (Ann Arbor, MI). Les lysats ont été dosés pour l'activité de la luciférase en utilisant les substrats fournis dans le kit et un spectromètre à scintillation équipé d'un moniteur de photon unique. Les échantillons ont été analysés en triple. Pour la mesure de l'activité de TGF totale, des aliquotes de milieu conditionné ont été chauffés à 80 ° C pendant 5 min et on les refroidit à température ambiante avant l'analyse.
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